jueves, 16 de julio de 2009

Resistencia a oseltamivir en influenza A

Las drogas establecidas para la terapia farmacológica de la influenza estacional tienen como blancos la proteína M2 (para amantadina y rimantadina) y la neuraminidasa (para oseltamivir y zanamivir). La aparición de resistencia viral ha reducido enormemente el ya discreto rol de amantadina y rimantadina.

¿Hay algún motivo por el cual no podría suceder lo mismo con el oseltamivir y el zanamivir? Después de todo, se emplean como monoterapia, muchas veces sin confirmación de la presencia del virus a tratar (la estrategia actualmente recomendada por las autoridades sanitarias en la Argentina, en el contexto de la epidemia). Por otra parte, no queda claro qué medida de monitoreo de resistencia (si alguna) se está tomando en nuestro medio.

Por lo tanto, consideré adecuado revisar, desde la óptica farmacológica, los factores de resistencia al oseltamivir por parte del virus A H1N1 pandémico.


El oseltamivir es, por el momento, el único fármaco activo por vía oral recomendado para la terapia de la influenza A pandémica, H1N1, en base a datos de tests de susceptibilidad in vitro (no por ensayos clínicos). El otro fármaco considerado, zanamivir, se administra por vía inhalatoria (en nebulización) y además de resultar menos conveniente (imaginemos: nebulizar en una Guardia atestada de gente...), no se halla comercialmente disponible en la Argentina.

Una búsqueda en www.pubmed.com con las palabras clave "oseltamivir" y "resistencia" en el día de hoy brinda 294 artículos, muchos de ellos publicados este año: el tópico reviste gran interés.

Hacer planes para un escenario hipotético de amplia resistencia al oseltamivir no es solamente una especulación, sino un imperativo de buena gestión farmacoepidemiológica.

¿Qué sabemos sobre los mecanismos de resistencia a oseltamivir por parte de la influenza A, H1N1?

Examinemos primeramente el mecanismo de acción: la neuraminidasa viral es el blanco molecular del oseltamivir y del zanamivir, para lo cual estos antivirales deben ligarse a la enzima. Si su ligadura se viera comprometida o bloqueada, estos fármacos resultarían inactivos. En la pasada epidemia de influenza aviar H5N1, el oseltamivir fue poco efectivo.

Aparentemente, son mutaciones puntuales, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, single nucleotide polymorphysm) las responsables de la resistencia viral. Por ejemplo, se reportó que el residuo hidrofóbico triptofano en posición 347 (Try347) en la secuencia de la neuraminidasa viral H5N1 no permite una ligadura adecuada del oseltamivir (Wang SQ et al. Biochem Biophys Res Commun 2009 Jun 10; e-pub).

¿Cómo sería posible generar resistencia al oseltamivir?
Una explicación posible sería la "presión de selección" ejercida por la presencia del oseltamivir en el medio ambiente. El metabolito activo del oseltamivir (oseltamivir carboxilato; OC) no es degradado en el entorno de los efluyentes cloacales, y persiste en medio acuoso. ¿Para tanto? Veamos: Söderström et al. publicaron (PlOS One 2009 Jun 26;4(6):e6064) la detección del antiviral en agua fluvial. Uno de los países con alto uso de oseltamivir es Japón, donde se lo emplea para la terapia de la gripe estacional. Determinaciones en el agua del río Yodo, en las prefecturas de Osaka y Kyoto, antes y después de la temporada de influenza 2007-2008 mostraron que el OC era indetectable antes de esa temporada, pero sus niveles fluctuaron entre 2 y 58 ng/l durante la misma. Falta establecer formalmente la relevancia clínica de este dato, de por sí sugestivo.

En Holanda, Jonges M et al (Antiviral Res 2009; Jul 7, e-pub) se ha extendido el uso de antivirales para el tratamiento de influenza en geriátricos y hospitales, así como para profilaxis en grupos de alto riesgo, y se mantienen stocks de los inhibidores de neuraminidasa en previsión de posibles epidemias. El sistema de vigilancia sanitaria holandés realizó análisis fenotípico y secuenció muestras virus de influenza humana recolectadas en las temporadas 2005-6, 2006-7 y 2007-8. Una alta proporción (74%) de virus estacionales A H3N2 exhibían una mutación crítica en la proteína M2, blanco de amantadina y rimantadina. En contraste, 98% de los virus influenza tipos A y B estacionales aislados antes de 2007 eran sensibles a oseltamivir y zanamivir, en tanto que 24% de los virus A (H1N1) estacionales obtenidos en 2007-8 resultaron oseltamivir-resistentes, pero zanamivir-sensibles y también sensibles a rimantadina y amantadina. Estos datos subrayan el valor de contar con un sistema nacional de monitoreo de sensibilidad y resistencia viral, establecido y sostenido a largo plazo (no sólo para una epidemia), con capacidad de brindar información de alto valor para fundamentar recomendaciones nacionales.


No siempre la "presión de selección" explica adecuadamente la aparición de resistencia. En Noruega, por ejemplo, se observó resistencia a oseltamivir en la influenza A H1N1 estacional, pero el consumo de oseltamivir fue muy modesto y las ventas fueron motivadas por el deseo de acumular stock, más que para uso inmediato. (Hauge S, et al. Virol J 2009; May 12; 6: 54). Debe haber otros mecanismos operativos.


¿De qué datos confiables se dispone, sobre resistencia al oseltamivir en influenza A H1N1 pandémica?
Hay dos vertientes de información: algunos datos publicados provienen de estudios realizados con otros tipos de influenza, pero arrojan información mecanística importante. Otros, disponibles recientemente, se abocan al virus pandémico.

Tratándose de una situación rápidamente cambiante, cualquier estimación o reporte puntual queda rápidamente desactualizado. Más que focalizarnos en la incidencia de resistencia (de la que hay y habrá elevado interés y numerosas publicaciones de aquí a futuro), prefiero que reflexionemos sobre la metodología de análisis de tal resistencia, ya que esto impacta en las decisiones terapéuticas y sanitarias.

Una investigación reciente sobre el virus pandémico en Thailandia mostró que el dominio transmembrana de la proteína M2 viral (básicamente, un canal iónico) había mutado sus sitios de ligadura de fármacos, en tanto que la proteína N1 mantenía su sitio "blanco" para el oseltamivir (Rungrotmonkol T, et al. Biochem Biophys Res Commun 2009 Jul 31;385(3):390-4). Esto correlaciona con las descripciones del CDC, (www.cdc.gov) según las cuales el virus A pandémico es casi 100% resistente a amantadina y rimantadina, pero es mayormente sensible a oseltamivir y zanamivir. Sin embargo, esta situación no tiene por qué mantenerse indefinidamente.

El tipo de tecnología de secuenciación genómica viral disponible hace una gran diferencia. El CDC (Atlanta, Georgia, EEUU) publicó resultados con una técnica de secuenciación de alto rendimeinto, con PCR en tiempo real ("real time PCR") en que se determina el pirofosfato liberado al incorporarse deoxinucleótidos (Deyde V, Gubareva L. Expert Rev Mol Diagn 2009 Jul;9(5):493-509) aplicada al análisis de resistencia al oseltamivir. Una cascada de reacciones enzimáticas convierte el pirofosfato en una señal lumínica registrada en forma de picos ("pirogramas") Esta metodología no sólo se aplica en la secuenciación viral sino también en farmacogenómica y otros tipos de diagnóstico molecular. El CDC utilizó esta técnica para monitorear la emergencia y difusión de resistencia al oseltamivir. Estos resultados son comunicados semanalmente en la página web del CDC (www.cdc.gov) y en su publicación semanal, MMWR (Morbidity and Mortality Weekly Report).

Una técnica rápida de identificación de resistencia del virus A H1N1 al oseltamivir (Guo L, et al. Antiviral Res 2009 Apr;82(1):29-33) es la detección de la mutación que codifica tirosina en vez de histidina en la posición 274 (H274Y) de la neuraminidasa N1 mediante técnicas moleculares de restricción, PCR en tiempo real y análisis de la secuencia del fragmento (RT-PCR/RLFP) para determinar presencia o ausencia de esa mutación, con un íimite de detección de 10 copias por reacción ("corrida"). Es un test simple, rápido y específico, útil para monitorear resistencia al antiviral.


¿Qué perspectivas habría en el desarrollo de fármacos contra nuevos blancos moleculares virales, específicamente contra el virus A H1N1?

No hay duda que en el corto plazo, una estrategia de uso prudente de los fármacos, en el conjunto de una campaña con medidas de educación pública (y profesional), higiene personal y otras medidas generales, representa el abordaje más adecuado.

A futuro, en cambio, es interesante plantearse la posibilidad de desarrollar nuevas medidas terapéuticas dirigidas contra otros blancos moleculares del virus (Krug R, Aramini J. Trends Pharmacol Sci 2009 Jun;30(6):269-77). Tanto los virus estacionales como los epidémicos H5N1 y H1N1 de influenza A desarrollan resistencia a las dos categorías de drogas ahora disponibles. La hemaglutinina es un blanco molecular interesante, con varias moléculas en etapas tempranas del desarrollo. Del mismo modo sucede con la proteína NS1A, la nucleoproteína y la polimerasa viral, tomando como base el análisis estructural.

Atentamente,
Pedro M. Politi





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